Poster presented at the 9. Fruehjahrs-Workshop "Molecular Modelling"
23 und 24 Mai 1995 - TH Darmstadt, Petersenstr 21, 64287 Darmstadt

Published: J. Mol. Mod. (1995), 1, 93.
Abstract: (English & Deutsch)


De Novo Design of Ligands to Block Substrate Access to Cytochrome P450cam

Michael Degenhardt and Rebecca Wade

European Molecular Biology Laboratory, Meyerhofstr.1, 69012 Heidelberg, Germany


Abstract:
Cytochrome P450cam is a monooxygenase from Pseudomonas putida that catalyses the stereospecific hydroxylation of camphor. The active site is buried in the protein and there is no direct access to it from the protein surface. Although the crystal structures of the substrate-free and substrate-bound proteins do not show any significant structural differences (Poulos et al 1985, 1986), the protein must undergo a conformational change in order for camphor to reach the active site. Differences in the mobility of certain side-chains in the substrate-free and the substrate-bound proteins suggest the location of a possible hydrophobic substrate access channel (Raag et al, 1993), and spectroscopic studies of camphor access to the active site suggest that the Asp251-Arg186 salt-link may be important in controlling substrate access (Deprez et al, 1994). There is a depression on the surface of the protein at the entrance to the proposed substrate access channel; close to this is a second depression lined by the Asp251-Arg186 salt-link. We have used de novo structure-based design techniques to model compounds to bind in these two depressions and thus, inhibit substrate access to the active site. Energetically favourable binding sites for different ligand moieties were located with the GRID program (Goodford, 1985, Boobbyer et al, 1989, Wade et al, 1993). Then the LUDI program (Boehm, 1992) was used to search databases for ligands that could bind in these sites. Additional moieties were modelled into the ligands to obtain compounds specific for the target binding sites and these will be used to investigate the substrate access mechanism.

Boehm H.J., J.Comput.-Aided Mol.Design, 1992, 6, 61.
Boobbyer,D.N.A., Goodford P.J., McWhinnie,P.M., Wade,R.C. J.Med.Chem., 1989, 32, 1083-1094.
Deprez E., Gerber N.C., Di Primo C., Douzou P., Sligar S.G., Hui Bon Hoa G., Biochemistry, 1994, 33, 14464
Goodford P.J., J.Med.Chem., 1985, 28, 849
Poulos T.L., Finzel B.C., Gunsalus I.C., Wagner G.C., Kraut J., J.Biol.Chem., 1985, 30, 16122
Poulos T.L., Finzel B.C., Howard A.J., Biochemistry, 1986, 25, 5314
Raag R., Hiuling Li, Jones B.C., Poulos T.L., Biochemistry, 1993, 32, 4571
Wade,R.C., Clark,K.J. Goodford,P.J. J. Med. Chem. 1993, 36, 140-147.
Wade,R.C., Goodford,P.J. J. Med. Chem. 1993, 36, 148-156.



De-Novo-Design von Liganden zur Blockierung der Substratzugaenglichkeit von Cytochrom P450cam

Michael Degenhardt und Rebecca Wade

Europaeisches Laboratorium fuer Molekularbiologie, Meyerhofstr.1, 69012 Heidelberg, Deutschland


Cytochrom P450cam ist eine Monooxygenase von Pseudomonas putida, die eine stereospezifische Hydroxylierung von Kampfer katalysiert. Das aktive Zentrum liegt im Innern des Proteins und hat keinen direkten Zugang zur Oberflaeche. Ein Vergleich der Kristallstrukturen des Enzymes mit und ohne Kampfer zeigt keine signifikanten Veraenderungen (Poulos et al, 1985, 1986), jedoch muss das Protein eine Konformationsaenderung durchfuehren, damit der Kampfer das aktive Zentrum erreicht. Unterschiede in der Mobilitaet einiger Seitenketten im Protein mit und ohne Kampher suggerieren die Existenz eines moeglichen nichtpolaren Substratkanals (Raag et al, 1993). Spektroskopische Untersuchungen zur Messung der Bindungsrate von Kampfer deuten auf eine Kontrolle des Zugangs durch eine Salzbruecke zwischen Asp251 und Arg186 hin (Deprez et al, 1994). Am Eingang des vermuteten Substratkanals befindet sich eine Vertiefung - eine weitere befindet sich in direkter Nachbarschaft nahe der Salzbruecke zwischen Asp251 und Arg186. Um den Substratzugang zum aktiven Zentrum beeinflussen haben wir mit Hilfe von Struktur-basierenden Designtechniken versucht, Verbindungen zu modellieren, die in diesen beiden Vertiefungen binden koennen. Mit dem GRID Program (Goodford, 1985, Boobbyer et al., 1989, Wade et al., 1993) wurde die Oberflaeche der beiden Bereiche untersucht, um Orte guenstiger Bindungsenergien fuer Liganden zu lokalisieren. Das Program LUDI (Boehm, 1992) wurde benutzt, um eine Datenbanksuche nach moeglichen Liganden durchzufuehren, die in den entsprechenden Bereichen binden. Schliesslich wurden Liganden hinsichtlich spezifischen Bindungsverhaltens durch Einfuehrung von Seitengruppen optimiert. Die modellierten Liganden koennen zum Studium der Substratzugaenglichkeit herangezogen werden.

Boehm H.J., J.Comput.-Aided Mol.Design, 1992, 6, 61.
Boobbyer,D.N.A., Goodford P.J., McWhinnie,P.M., Wade,R.C. J.Med.Chem., 1989, 32, 1083-1094.
Deprez E., Gerber N.C., Di Primo C., Douzou P., Sligar S.G., Hui Bon Hoa G., Biochemistry, 1994, 33, 14464
Goodford P.J., J.Med.Chem., 1985, 28, 849
Poulos T.L., Finzel B.C., Gunsalus I.C., Wagner G.C., Kraut J., J.Biol.Chem., 1985, 30, 16122
Poulos T.L., Finzel B.C., Howard A.J., Biochemistry, 1986, 25, 5314
Raag R., Hiuling Li, Jones B.C., Poulos T.L., Biochemistry, 1993, 32, 4571
Wade,R.C., Clark,K.J. Goodford,P.J. J. Med. Chem. 1993, 36, 140-147.
Wade,R.C., Goodford,P.J. J. Med. Chem. 1993, 36, 148-156.


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